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鎳瓊脂糖凝膠
英文名稱:Ni-Berpharose FF
貨號:B2824
規格:1ml
1. 產品介紹
鎳-瓊脂糖凝膠FF以瓊脂糖微球為基質,活化偶聯亞氨基二乙酸(IDA),之后螯合Ni2+。IDA是金屬螯合層析中最-常用的配體,和次氮基三乙酸(NTA)相比,IDA具有親和力強、載量高、可再生重復使用等優點。
鎳-瓊脂糖凝膠FF主要用于純化含有組-氨酸標簽(His-Tag)的重組蛋白。組-氨酸標簽中的咪唑環同過渡金屬Ni2+形成穩定的配位鍵,能特異、牢固和可逆地吸附在固定有Ni2+的基質上,可通過增加咪唑濃度對重組蛋白進行競爭洗脫。
2.規格
1ml(預裝柱)、5ml(預裝柱)、10ml(預裝柱)、20ml、100ml、500ml 純化流程
①平衡
鎳-瓊脂糖凝膠FF柱用2~5個柱體積的初始緩沖溶液進行平衡。
建議流速為100 cm/h。
②上樣
(1)樣品一般溶解于pH6~8的初始緩沖液中。提高上樣緩沖液的pH值可以增大載量。
(2)緩沖液中不能含有EDTA和檸檬酸鹽,同時最好避免巰基乙醇、DTT等還原劑。
(3)常用緩沖液有10~100 mM磷酸鈉緩沖液、20~200 mM Tris-HCl緩沖液等。
(4)緩沖液中一般要加入0.15~0.5 M的NaCl以消除離子交換作用。
(5)初次使用鎳-瓊脂糖凝膠FF時,推薦使用50 mM PBS(50 mM NaH2PO4,0.5 M NaCl,pH 7.4)作為初始緩沖液。
③洗脫
(1)增加咪唑濃度進行洗脫是鎳-瓊脂糖凝膠FF最-常用的洗脫方法。
(2)咪唑為堿性,相應緩沖液配制后需要用HCl調節pH值。
(3)初次使用鎳-瓊脂糖凝膠FF時,如不確定洗脫需要的咪唑濃度,推薦在初始緩沖液中分別加入10 mM、20 mM、50 mM、100 mM、200 mM、500 mM咪唑,濃度從低
到高分別洗脫和收集重組蛋白,之后通過SDS-PAGE電泳等方法鑒定洗脫結果。
(4)有條件的可以進行咪唑梯度線性洗脫以確定較佳的洗脫條件。
洗脫方法
(1)降低pH洗脫:大多數蛋白在pH6~4會被洗脫下來(也可以在pH 3~4),緩沖液可以是醋酸鈉、檸檬酸和磷酸鹽緩沖體系。
(2)競爭性洗脫:線性增加或一步增加同金屬離子有親和力的競爭物質的濃度(如0~0.5M咪唑、0~50 mM組-氨酸、0~2M NH4Cl)。梯度洗脫最好在起始緩沖液的恒定pH值下進行。
(3)螯合劑洗脫:EDTA、EGTA等螯合劑可同金屬離子產生作用力,導致蛋白被洗脫下來。此法不能分離不同的蛋白,還會影響蛋白的吸附,導致融合蛋白無法掛柱。
注:降低pH洗脫和螯合劑洗脫會使得金屬離子脫落,下次使用前需要重新螯和金屬離子。最-常用的方法為競爭性洗脫。
上述洗脫方法,均須在緩沖液中加入150 ~500mM的NaCl以消除離子交換作用。
5.再生、清洗、保存
①凝膠再生
(1)多次使用后或需要更換螯合的金屬離子時,必須將凝膠脫鎳再生。脫鎳方法:用5~10個柱體積的蒸餾水淋洗柱子,再用5~10個柱體積的100 mM EDTA淋洗柱子,最后用2~3個柱體積的0.5 M NaCl洗掉殘留的EDTA。
(2)多次使用的柱子脫鎳后一般需要進行清洗。清洗方法:用0.1~1.0 M NaOH反向清洗柱子,50 cm/h保持1~2 h,能去除結合強的雜質,同時也能去除熱源。
(3)清洗后需要重新螯合金屬離子。螯合方法:用2~5個柱體積的蒸餾水充分平衡脫鎳后的柱子,用0.1~0.3 M金屬鹽溶液過柱5~10個柱體積以螯合金屬離子,之后用5~10個柱體積的蒸餾水淋洗以去除未螯合的金屬離子。
②在位清洗
(1)去除因離子交換作用吸附的蛋白:2~3個柱體積的2 M NaCl溶液反向清洗。
(2)去除強疏水性蛋白和脂質等:4個柱體積的70%乙醇或者30%異丙醇反向清洗。
(3)除去蛋白沉淀、疏水性蛋白:參照凝膠再生步驟。
6.注意事項:
1)使用時保證柱子和緩沖液的溫度一致,避免柱床內產生氣泡,影響純化效果。
2)本產品保存條件為20%乙醇,4~8℃。
3) 2-25℃,常壓,避光運輸
4)僅供科研實驗使用
鎳瓊脂糖凝膠