PRODUCT CLASSIFICATION
產(chǎn)品分類你知道明膠酶譜法試劑盒是由什么組成的嗎?
基質金屬蛋白酶(mmp2/9)試劑盒適用: 檢測 MMP-2、MMP-9 酶譜及活性(Detect MMP2 and MMP9 as low as 1 nM)。
組成與儲存 (50 assays):
1.2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml µl, 20 ºC;
2.10 × Substrate G, 50 ml, 20 ºC;
3. 10 × Buffer A, 50 ml, 4 ºC, 使用時用蒸餾水稀釋;
4. 10 × Buffer B, 50 ml, 4 ºC, 使用時用蒸餾水稀釋;
5. SDS-PAGE 凝膠蛋白質考馬斯亮藍染色液, 4 ºC。
檢測步驟:
1. 制備含 MMP 底物蛋白的 SDS-PAGE 凝膠:推薦分離膠濃度為 8%。按照標準程序制備 SDS- PAGE 凝膠。將 10 × substrate G 融化,并 90 ºC 加熱 5 分鐘。分別在濃縮膠和分離膠中額外加 入 10 × substrate G 并使之稀釋 10 倍,混勻后加入過硫酸銨和 TEMED,等待凝膠聚合。
2. 待測樣品 1:1 稀釋于 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制:4% SDS, 100 mM Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue),混合后直接上樣。切勿加熱變性,并且僅 使用不加還原劑的上樣緩沖液。可通過預試驗確定加樣量,使用普通蛋白預染 Marker 即可。陽 性對照(可選步驟):可取人、小鼠、大鼠或兔 100µl 全血與 100µl 2 × SDS-PAGE non-
reducing buffer 等體積混合,取 5-15µl 上樣。
3. 低電流恒流電泳,每一塊小膠電流為 20mA/gel。溴酚藍跑出凝膠前沿時結束電泳。
4. 洗滌凝膠:取出凝膠,去除濃縮膠,放入容器內.可先用適量蒸餾水沖洗凝膠,然后加入10ml
1× Buffer A(用蒸餾水稀釋),室溫漂洗凝膠 2 × 30 分鐘。中間換液。
5. 孵育:倒掉 Buffer A。加入 10 ml 1× Buffer B(蒸餾水稀釋),室溫或 37ºC 孵育 1~5 小時。陽性 對 照或者血中的 MMP 通常 37ºC 孵育 1 小時即可顯示。如 MMP 活性低,應延長孵育時間為 10 小時或 過一夜。
6. 顯色:倒掉 Buffer B,加入 SDS-PAGE 凝膠蛋白質考馬斯亮藍染色液(操作步驟見 SDS-PAGE 凝 膠蛋白質考馬斯亮藍染色液說明書)。凝膠的大部分區(qū)域被深染,在有 MMP 條帶的位置 不被染 色而形成透亮區(qū)域。透明區(qū)域的位置和范圍指示 MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及 活性。陽 性對照將在 66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa 位置出現(xiàn)透明條帶。
7. 條帶掃描:將凝膠放在掃描儀上掃描。雖然 MMP 條帶透明,但凝膠背景并非真正全黑。解決 辦法:可用非透射光掃描,或用軟件圖像處理程序調整背景顯示為灰度顯示,并盡量設置為黑色.MMP條帶則為白色,這種背景黑條帶白的格式是英文論文中zui常見的格式。
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