PRODUCT CLASSIFICATION
產(chǎn)品分類祝賀復(fù)旦大學(xué)老師訂購我司:細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒,上海信帆供應(yīng)細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒,產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定,*,歡迎聯(lián)系!
產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品包裝 |
0027 | 細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒 | 50次 |
在研究細(xì)胞時經(jīng)常要研究細(xì)胞的不同組份,而研究得多的兩個細(xì)胞組份就是細(xì)胞核和細(xì)胞漿。分離細(xì)胞核蛋白和細(xì)胞漿蛋白,不僅可以用于研究蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位,而且很多時候分離出來的核蛋白可以用于轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面的研究,例如EMSA(也稱gel shift),footprinting等。
細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒(Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit)提供了一種比較簡單、方便的從培養(yǎng)細(xì)胞或新鮮組織中抽提細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白的方法。約90分鐘就可以完成培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白的分離。抽提得到的蛋白可以用于Western,EMSA,footprinting,報告基因檢測以及酶活力測定等后續(xù)操作。
本試劑盒是通過細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A和B,在低滲透壓條件下,使細(xì)胞充分膨脹,然后破壞細(xì)胞膜,釋放出細(xì)胞漿蛋白,然后通過離心得到細(xì)胞核沉淀。后通過高鹽的細(xì)胞核蛋白抽提試劑抽提得到細(xì)胞核蛋白。
對于細(xì)胞樣品,如果每個樣品的數(shù)量不超過二百萬個細(xì)胞,本試劑盒可以抽提50個樣品;對于組織樣品,如果每個樣品的重量不超過30毫克,本試劑盒可以抽提50個樣品,如果每個樣品約為30-60毫克,本試劑盒可以抽提37個樣品。
包裝清單:
產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
0027-1 | 細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A | 15ml |
0027-2 | 細(xì)胞漿蛋白抽提試劑B | 0.5ml |
0027-3 | 細(xì)胞核蛋白抽提試劑 | 2.5ml |
— | 說明書 | 1份 |
保存條件:
-20℃保存,一年有效。
使用說明:
1. 準(zhǔn)備溶液:室溫融解試劑盒中的三種試劑,溶解后立即放置在冰上,混勻。取適當(dāng)量的細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A備用,在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF,使PMSF的終濃度為1mM。取適當(dāng)量的細(xì)胞核蛋白抽提試劑備用,在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF,使PMSF的終濃度為1mM。
2. 對于貼壁細(xì)胞:用PBS洗一遍,用細(xì)胞刮子刮下細(xì)胞,或用EDTA溶液處理細(xì)胞使細(xì)胞不再貼壁很緊,并用移液器吹打下細(xì)胞。離心收集細(xì)胞,盡大努力吸盡上清,留下細(xì)胞沉淀備用。盡量避免用胰酶消化細(xì)胞,以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。
3. 對于懸浮細(xì)胞:用PBS洗一遍,離心收集細(xì)胞,盡大努力吸盡上清,留下細(xì)胞沉淀備用。
4. 每20微升細(xì)胞沉淀加入200微升添加了PMSF的細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A。(對于二百萬HeLa細(xì)胞,其細(xì)胞沉淀的體積大約為20微升或40毫克。)
5. 高速劇烈Vortex 5秒,把細(xì)胞沉淀*懸浮并分散開。(如果細(xì)胞沉淀沒有*懸浮并分散開,可以適當(dāng)延長vortex時間。)
6. 冰浴10-15分鐘。
7. 加入細(xì)胞漿蛋白抽提試劑B 10微升。高速劇烈Vortex 5秒,冰浴1分鐘。
8. 高速劇烈Vortex 5秒,4℃ 12,000-16,000g離心5分鐘。
9. 立即吸取上清至一預(yù)冷的塑料管中,即為抽提得到的細(xì)胞漿蛋白。可以立即使用,也可以凍存。(千萬不要觸及沉淀,可以在沉淀上方保留極小體積的上清,以免觸及沉淀。每200萬細(xì)胞用200微升本產(chǎn)品中的細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A裂解后可獲得的上清,其細(xì)胞漿蛋白濃度約為2-5mg/ml,不同細(xì)胞有所不同。)
10. 對于沉淀,*吸盡殘余的上清,加入50微升添加了PMSF的細(xì)胞核蛋白抽提試劑。(不吸盡上清會帶來細(xì)胞漿蛋白的污染。)
11. 高速劇烈Vortex 15-30秒,把細(xì)胞沉淀*懸浮并分散開。然后放回冰浴中,每隔1-2分鐘再高速劇烈Vortex 15-30秒,共30分鐘。
12. 4℃ 12,000-16,000g離心10分鐘。
13. 立即吸取上清至一預(yù)冷的塑料管中,即為抽提得到的細(xì)胞核蛋白。可以立即使用,也可以-70℃凍存。每200萬細(xì)胞用50微升本產(chǎn)品中的細(xì)胞核蛋白抽提試劑裂解后獲得的上清,其細(xì)胞核蛋白濃度約為1.2-3.0mg/ml,不同細(xì)胞有所不同。
14. 對于新鮮組織:
a. 把組織盡可能切成非常細(xì)小的碎片。按照20:1的比例混合適當(dāng)量的細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A和B(例如200微升細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A中加入10微升抽提試劑B)。并加入PMSF至終濃度為1mM配制成組織勻漿液。按照每60mg組織加入200微升組織勻漿液的比例混合組織和組織勻漿液(對于不超過30mg的組織樣品,僅需加入100微升組織勻漿液),并在玻璃勻漿器內(nèi)充分勻漿。勻漿需在冰浴或4℃進(jìn)行。
b. 勻漿后把勻漿液轉(zhuǎn)移到塑料離心管內(nèi),冰浴放置15分鐘。
c. 4℃ 1,500g離心5分鐘。把上清轉(zhuǎn)移至一預(yù)冷的塑料管中,為抽提得到的部分細(xì)胞漿蛋白。(吸上清時千萬不要觸及沉淀。)
d. 對于沉淀,到了這一步已經(jīng)充分勻漿,但很多細(xì)胞還沒有破碎。接下去按照使用說明的步驟4開始操作,即把沉淀當(dāng)做已經(jīng)離心收集好的細(xì)胞沉淀操作,按照步驟4至步驟13抽提得到細(xì)胞漿蛋白和細(xì)胞核蛋白(特別說明:對于起始量為30-60mg的組織樣品,后續(xù)直接按照步驟4-13操作即可;對于起始量不超過30mg的組織樣品,后續(xù)步驟4-13中的溶液的用量須減半使用)。抽提得到的細(xì)胞漿蛋白可以和步驟14c中抽提得到的細(xì)胞漿蛋白合并。新鮮的肝臟組織用本產(chǎn)品裂解后獲得的上清,其細(xì)胞漿蛋白濃度約為3-10mg/ml,細(xì)胞核蛋白濃度約為3-10mg/ml,不同狀態(tài)的不同組織有所不同。
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