ELISA測定錯誤結果的原因分析
ELISA即酶聯(lián)免疫吸附試驗，是一種常用的固相酶免疫測定方法。Engvall 和Perlmann于1971年zui先應用該法進行了IgG定量測定，并命名為"enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）"。 ELISA的基本原理是：
①使抗原（或抗體）結合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性；
②使抗原（或抗體）與某種酶聯(lián)結成酶標抗原（或抗體），而且此酶標抗原（或抗體）既保留其免疫活性，又保留其酶活性；
③測定時將受檢標本（抗體或抗原）和酶標抗原（或抗體）按不同步驟與固相載體表面的抗原或抗體進行反應，再用洗滌方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其它物質(zhì)分開，zui后結合在固相載體上的酶量與標本中受檢的抗體或抗原量成一定比例；再加入酶反應底物后，底物被酶催化后變?yōu)橛猩a(chǎn)物，根據(jù)其顏色反應的深淺進行定性或定量分析，以了解被測標本中抗體或抗原含量。 
ELISA方法被廣泛應用于各種抗原和抗體測定。但ELISA測定中影響因素較多，而且其操作中有一定的技術要求，在研究檢驗中除正常反應外，有時常可見到一些錯誤結果（即假陽性或假陰性結果）。引起ELISA測定錯誤結果的原因主要有：
①標本因素；
②試劑因素；
③操作因素。
本文就標本因素對ELISA測定的影響做如下討論。 
血清是zui常用的ELISA標本，血漿一般可視為與血清同等的標本，標本引起的假陽性和假陰性結果主要是干擾性物質(zhì)所致，分為內(nèi)源性物質(zhì)和外源性物質(zhì)兩種：
1． 內(nèi)源性物質(zhì) 有人認為大約40%的科研血清標本中含有非特異性干擾物質(zhì)，可以不同程度影響檢測結果。常見的干擾物質(zhì)有：類風濕因子、補體、嗜異性抗體、嗜靶抗原自身抗體、醫(yī)源性誘導的抗鼠Ig （s）抗體、交叉反應物質(zhì)和其它物質(zhì)等。 
（1）類風濕因子 
科研血清中IgM、IgG型類風濕因子（RF）可以與ELISA系統(tǒng)中的捕獲抗體及酶標記二抗的FC段直接結合，從而導致假陽性。
解決該情況的辦法是：
①用F（ab）2替代完整的IgG；
②標本用聯(lián)有熱變性（63℃，10 min）IgG的固相吸附劑處理（將熱變性IgG加入到標本稀釋液中同樣有效）；③檢測抗原時，可以用等加入到標本稀釋液中，使RF降解。 
（2）補體 ELISA系統(tǒng)中固相一抗和標記二抗過程中，抗體分子發(fā)生變構，其FC段的補體C1q分子結合位點被暴露出來，使C1q 可以將二者連接起來，從而造成假陽性。解決的辦法是：①用EDTA稀釋標本；②用53℃，10 min或56℃，30 min加熱血清使C1q滅活。 
（3）嗜異性抗體 人類血清中含有能與嚙齒類動物（如鼠等）Ig （s） 結合的天然嗜異性抗體，可將ELISA系統(tǒng)中一抗和二抗連接起來，也能造成假陽性。解決的辦法是：可在標本稀釋液中加入過量的動物Ig （s） ，但加入量不足或亞類不同時無效。 
（4）嗜靶抗原的自身抗體 抗甲狀腺球蛋白、抗胰島素等嗜靶抗原的自身抗體，有時能與靶抗原結合形成復合物，在ELISA方法中均可干擾抗原抗體測定結果。為避免以上情況出現(xiàn)，解決的辦法是：測定前需用理化方法將其解離后再測定。 
（5）醫(yī)源性誘導的抗鼠Ig （s） 抗體 研究開展的用鼠源性CD3等單克隆抗體治療，用放射性同位素標記鼠源性抗體的影像診斷及靶向治療等新技術，均有可能使這些樣本體內(nèi)產(chǎn)生抗鼠抗體；另外，被鼠等嚙齒類動物咬傷的樣本體內(nèi)也可以產(chǎn)生抗鼠Ig （s） 抗體。這些樣本ELISA測定時均可產(chǎn)生假陽性。解決的辦法是：測定抗原時，在標本中加入足量的正常鼠Ig （s） ，從而克服由于上述原因造成的假陽性。 
（6）交叉反應物質(zhì) 類地高辛、類AFP樣物質(zhì)等，是與靶抗原有交叉反應的物質(zhì)。在用多抗測定抗原時對測定結果影響不大，但在用單克隆抗體測定抗原時，如果交叉抗原決定簇正好是所用單克隆抗體相對應的靶決定簇時，也會出現(xiàn)假陽性結果。 
（7）標本中其它成分的影響 血清脂質(zhì)過高、膽紅素、血紅蛋白及血液粘度過大等，均對ELISA測定結果有干擾作用。 
2． 外源性物質(zhì) 
外源性物質(zhì)常常是由于用于ELISA測定的血標本的采集、貯存等不當所致。如標本溶血、標本被細菌污染、標本貯存過久、標本凝集不全和采血管中添加物等影響。 
（1）標本溶血 由于各種人為原因引起的標本溶血，均可因紅細胞破壞溶解時釋放出大量具有過氧化物酶活性的血紅蛋白，在以辣根過氧化物酶為標記的ELISA測定中，會導致非特異性顯色，干擾測定結果。為克服上述干擾作用，標本采集時必須注意避免溶血。 
（2）標本受細菌污染 因菌體中可能含有內(nèi)源性辣根過氧化物酶，因此，被細菌污染的標本同溶血標本一樣，亦可產(chǎn)生非特異性顯色而干擾測定結果。 
（3）標本保存不當 在冰箱中保存過久的標本，血清中IgG可聚合成多聚體、AFP可形成二聚體，在間接法ELISA測定中會導致本底過深、甚至造成假陽性；標本放置時間過長（如一天以上），有時抗原或抗體免疫活性減弱，亦可出現(xiàn)假陰性。為克服上述干擾，ELISA測定的血清標本宜為新鮮采集；如不能立即測定，5天內(nèi)測定的血清標本可存放于4℃，1周后測定的血清標本應低溫凍存；凍存后融解的標本，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應充分混合后再測定，但混勻時應輕柔，不可強烈振蕩。 
（4）標本凝集不全 在沒有促凝劑和抗凝劑存在的情況下，正常血液采集后1/2~2h開始凝固，18~24h*凝固。研究檢驗工作中，有時為了爭取時間快速檢測，常在血液還未開始凝固時即強行離心分離血清，此時的血清中仍殘留部分纖維蛋白原，在ELISA測定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊，易造成假陽性結果；這類情況于次日復查時因血凝已*，血清中不再有纖維蛋白原存在，故復查結果變?yōu)殛幮浴楸苊馍鲜龈蓴_作用，解決的辦法是血液標本采集后必須使其充分凝固后再分離血清，或標本采集時用帶分離膠的采血管或于采血管中加入適當?shù)拇倌齽?nbsp;
（5）標本管中添加物質(zhì)的影響 抗凝劑（如肝素，EDTA）、酶抑制劑（如NaN3可抑制ELISA系統(tǒng)中辣根過氧化物酶活性）及快速分離血清的分離膠等均對ELISA測定有一定干擾作用。 綜上所述，對研究檢驗ELISA測定中出現(xiàn)的假陽性或假陰性結果，在考慮試劑因素和操作因素之外，更多的應從標本因素方面進行分析，并應采取相應措施排除干擾作用，從而為研究提供正確可靠的檢測結果。

酶聯(lián)免疫（ELISA）使用試劑盒檢測過程中值得關注的問題
1、儀器質(zhì)控
 為使儀器保持工作狀態(tài)，應建立維護和校正儀器的標準操作程序（SOP），所要控制的儀器包括移液器（加樣槍）、溫箱、洗板機和酶標儀。
◎移液器： ELISA加樣量小（20-200μl），其準確性直接影響實驗結果，利用稱重法檢查：低、中、高三個刻度分別吸取指示量的水，萬分之一天平稱重后計算吸量是否準確，一般應在±5%以內(nèi)；
◎恒溫箱： 經(jīng)常檢查恒溫箱溫度計所示的溫度和水中（或溫箱內(nèi)）實測溫度是否一致，允許有±1℃的誤差；
◎洗板機： 每個廠家設置洗板后的殘留液有各自的規(guī)定，一般不超過2μl；人工扣板時，墊紙不濕；定期檢查管孔是否堵塞；
◎酶標儀：經(jīng)常維護其光學部分，防止濾光片霉變，定期檢測校正，使其保持良好的工作性能。
2、試劑盒選擇
◎應盡量選擇正規(guī)廠家，產(chǎn)品經(jīng)相應政府部門審核認可，試劑應從靈敏度、特異性、精密度、穩(wěn)定性、簡便性、安全性及經(jīng)濟性全面評價。
◎靈敏度：有二層含義，1）為試劑檢出被檢物質(zhì)的zui低量的能力；2）為試劑對大量樣品中陽性檢出的能力。
◎特異性：常用交叉反應率表示。含有與待測物相近結構部份的物質(zhì)可能存在交叉反應，使測定結果升高，可能導致假陽性，所以交叉反應是評價其質(zhì)量的關鍵指標。
◎精密度：ELISA試劑一般指其批內(nèi)CV%，其值應小于15%；定量試劑應同時考察線性范圍。
◎準確度：通過添加回收實驗進行評價。
◎簡便性：指在不影響試劑的前三項指標的前題下，實驗和測定步驟越少越好，在定性實驗中結果判斷簡單明了，定量試驗結果計算也應簡單。
◎安全性：指試劑對操作者和環(huán)境安全無害無傳染性。
◎經(jīng)濟性：試劑在同等質(zhì)量條件下通過大規(guī)模生物試劑或技術進步降低成本，而市場價格比較合理。
◎試劑評價：需要有的確證方法和確證的樣品進行檢測。
3、樣本前處理注意事項
3.1 均質(zhì)
組織樣本:肉、肝食品類切細，用絞肉機反復絞碎，混合均勻。
水產(chǎn)樣本：去除樣品的非食用部分，食用部分切細，用均質(zhì)器均漿；原料表面較臟時,需適當用蒸餾水清洗。
蛋類：鮮蛋去殼，蛋黃和蛋白充分混勻。
水果、蔬菜類：先用水洗去泥沙，然后除去表面的水分，取食用部分。
3.2 振蕩提取
 將提取溶劑加入到裝有樣品的具塞容器中，振蕩，使提取溶劑與容器內(nèi)的樣品充分接觸以深入到樣本組織內(nèi)部，提取待測組分。
3.2.1振蕩方式：振蕩器上進行上下、往返式振蕩、手搖式上下振蕩。
3.2.2 在組織樣本中加入有機溶劑之間提取時，應邊加邊振蕩，防止組織凝結成團，不利于提取。
3.3. 在用有機溶劑提取過程中，如果出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，解決的方法有：①用細頭輕輕的攪拌，破壞乳化后，再重復離心。②再加入適量的提取劑，重新振蕩。注意離心后要保證樣本的稀釋倍數(shù)不變。
3.4 濃縮
 由于凈化過程中引入的溶劑，可能會降低待測組分的濃度或者不適宜直接分析，需要去除全部有機溶劑。即試劑盒前處理步驟中把樣本在60℃氮氣下吹干，再用復溶液溶解干燥殘留物。
濃縮方式：
 氮氣吹干除雜、壓縮空氣吹干除雜。
注意：
3.4.1在吹干樣本之前，用甲醇清洗針頭，防止雜質(zhì)干擾。
3.4.2在吹樣本時，針頭應在液面上空，避免與樣本接觸，防止產(chǎn)生交叉污染。
3.4.3樣本吹干后應立即取下，避免吹的時間過長，影響zui終檢測結果。
3.4.4不同的藥物，吹干后樣本的保質(zhì)期不同，提倡待樣本回到室溫后立即復溶。
3.5 凈化
 經(jīng)過提取的待測組分中通常含有一些會干擾試劑盒中抗原抗體反應的雜質(zhì)或者是含有與待測物結構相似的雜質(zhì)。將待測組分與雜質(zhì)分離的過程，我們稱為試劑盒中樣本的凈化。在我們現(xiàn)有的試劑盒前處理方法中涉及到的zui常見的凈化是：液液分配法。
 比如：用復溶液溶解干燥殘留物之前先加入適量的正己烷，在加入正己烷和復溶液渦動后如果出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，可以60℃水浴加熱，至乳化現(xiàn)象消失或減弱后，加大離心轉速進行離心。
 實例：
 A、氟喹諾酮類藥物試劑盒現(xiàn)有的水產(chǎn)樣本前處理方法中，用二氯甲烷作為提取劑。
注意：
 （a）二氯甲烷的密度比水大，離心完后，二氯甲烷在下層，須先用加樣器吸盡上層廢液后，再按要求取適量的下層吹干。
 （b）在用加樣器吸取下層的有機相時，正常操作往往取量不準確，此時用帶有刻度，且刻度較準確的玻璃管來定量。
 （c）上訴情況對有經(jīng)驗的試驗員還可以通過靈活控制加樣器來控制取樣的準確性。
 （d）在振蕩過程中要注意安全。二氯甲烷在振蕩的過程中，如果離心管密封性不是很好，往往容易爆開；在進行振蕩時，不要讓離心管口對準自己或者其他人，避免濺到自己或者他人身上。
 （e）試劑盒在使用前充分回溫很必要，如回溫不充分該項目曲線受影響較明顯。
    B、硝基呋喃代謝物檢測過程中常見問題
    硝基呋喃代謝物有四種：3-氨基-2-唑烷基酮（AOZ）、5-甲基嗎啉-3-氨基-2-唑烷基酮（AMOZ）、氨基脲（SEM）和1-氨基-2-內(nèi)酰脲（AHD）在檢測過程中也需要同其它項目一樣進行添加回收測評，其中需要注意以下幾個問題。
    代謝物在組織中是與蛋白呈結合狀態(tài)，采用普通的有機溶劑或緩沖液，是無法提取該代謝物的。需要用鹽酸水解后才能使呋喃類代謝物游離，所以在加入去離子水、鹽酸和2-硝基苯甲醛（2-NBA）混合均勻后，其pH應在1-3之間，否則不利用水解代謝物。
在衍生化過程中，溫度和時間決定其衍生化產(chǎn)率，衍生化后在加入氫氧化鈉和磷酸氫二鉀時，其pH應在中性左右。由于部分樣本的緩沖能力不同，所以需對其pH進行測定，因為在酸性或堿性環(huán)境中，不利于呋喃類代謝物的提取回收，同時也容易出現(xiàn)假陽性。
    添加回收的幾種誤區(qū)：
    呋喃類代謝物提取過程通常分三個關鍵步驟：
 水解-----衍生化-----提取
 （1）采用標準曲線的zui大標準濃度進行添加回收。如德國拜發(fā)和我公司AOZ試劑盒中的第6個標準點4.05ppb，AMOZ試劑盒中的第6個標準點8.1ppb。因為這些標準品是已經(jīng)過衍生化后的標準品，不能代表樣本前處理實驗中的加酸水解和加衍生化試劑衍生這兩個步驟，所以就算回收率很高，但失去了實際參考價值。
 （2）*依賴未衍生的代謝物標準品進行添加回收。因部分未衍生的代謝物在配制成標準品后有一定的有效期，會存在潛在的不穩(wěn)定因素，而且添加回收僅能考證衍生化和提取兩個關鍵點，不能驗證從組織蛋白中水解呋喃類代謝物的過程，因此也有一定的局限性。
 的評價方案：采用經(jīng)LC-MS-MS確證的陰陽性樣品，留作質(zhì)控樣品，對檢測的樣本和試劑盒進行質(zhì)量評價。這也是實驗室所出數(shù)據(jù)可信度說服力的關鍵點。
4、 酶標分析過程中的注意事項
     樣本的檢測是基于抗原抗體的反應，根據(jù)標準曲線，判定樣本zui終的藥物含量。它要求加樣的準確性和洗板的一致性。在整個加樣的過程中注意實驗室溫度的恒定，保證反應在試劑盒所示的溫度下進行。
4.1常見加樣方式
A、吸一打二
B、吸二打一
 在實際操作過程中，提倡用“吸二打一"用這種方式，有如下幾個好處：
 a、加樣過程中在板孔內(nèi)不出現(xiàn)或者很少出現(xiàn)氣泡
 b、提高加樣速度，縮短前后樣本反應的時間差。
在加樣的過程中還應細心注意避免出現(xiàn)下列現(xiàn)象：
A、加樣的過程中漏加或者重加；
B、加樣的過程中忘記更換吸頭；
C、樣本的重加或者漏加；
D、忘記記錄樣本的加樣順序。
4.2常見的洗板方式
A、洗板機洗板；
B、多道孔加樣器洗板；
C、多孔吸頭洗板；
   在洗板的過程中，確保每孔所加洗滌液量的均一，按說明書操作，不可過多，避免溢出板孔，污染其它樣本；過少，則達不到洗滌的效果，容易出現(xiàn)曲線不成線性，花板等情況。
4.3 甩板
 快速甩盡板孔內(nèi)的液體，防止板孔里的液體對流或反濺回板孔中產(chǎn)生交叉污染。
4.4拍板
 輕輕的在吸水紙上扣干板孔內(nèi)的液體，而且吸水紙只能使用一次。
4.5 顯色
 值得注意的是，并非試劑盒中所規(guī)定的顯色時間是的，因為試劑盒的吸光度值會受環(huán)境中的溫度、濕度、酶標板反應時所接觸到的物品的導熱度等有關，實驗操作人員在加完顯色液后，可根據(jù)顏色的深淺適當?shù)难娱L或者縮短顯色時間。防止出現(xiàn)吸光值接近或高于酶標儀的zui高檢測靈敏度（OD值在2.5-3.0之間），這樣會間接影響到檢測結果，如出現(xiàn)曲線前半部份梯度不明顯或顛倒數(shù)值等現(xiàn)象，也就造成了一些假陽性或部分檢測結果偏低的現(xiàn)象。

ELISA技術要點和常見問題
在ELISA實驗前的注意事項 
仔細閱讀說明書確定試劑盒在有效期內(nèi)按說明書確定所有試劑齊全（數(shù)量、體積）標本制備要規(guī)范，每份標本體積要按2-3個復孔以上的量制備（貯存），盡量分裝做備份。短期內(nèi)無法實驗者，注意低溫保存準備好所有實驗額外所需物品，如試管、吸頭、移液器、離心機等根據(jù)檢測標本數(shù)量確定所需試劑的量按說明書將所用試劑平衡至室溫，配制所需試劑
DIY夾心法ELISA常見技術指南 
選擇抗體時選擇一個單抗和一個多抗進行配對；若選擇兩個單抗，必須識別不同表位的抗體；從同一家公司選擇抗體對。ELISA實驗中為了確定佳信號和zui低背景應將捕獲抗體（0.5-4μg/ml）和檢測抗體（0.25-2μg/ml）在預實驗中進行彼此相抗的滴定。同時，應包括在適當范圍內(nèi)的標準品的系列稀釋。按試劑說明書常規(guī)提供的范圍進行操作。標準品的配制：對于每種細胞因子應仔細閱讀說明書，注意每批的細節(jié)。在使用細胞因子前，瞬時離心試劑瓶，盡可能多地收回其中的細胞因子。根據(jù)每批說明書中的細節(jié)，將凍干的細胞因子復溶。一般待測抗原標準曲線的線性范圍的可通過將標準品做8次2倍系列稀釋從2000pg/ml 到15pg/ml。可利用標準的ELISA操作流程、放大試劑盒、第三類試劑、或改變酶底物系統(tǒng)可在一定范圍內(nèi)提高靈敏度。為了優(yōu)化靈敏度，建議過一晚孵育標準品和標本。若使用過氧化物酶作為顯色系統(tǒng)，應嚴禁在洗液和稀釋液中加疊氮鈉，疊氮鈉可抑制過氧化物酶的活性。當測定混合液體中的抗原時，如血清，建議在標本稀釋液中加不相干的Ig.
ELISA常見問題及處理對策 
問題 
可能原因 
解決方法 
無顏色
試劑孵育的時間沒有按說明書操作。確定生物素化抗體，連接的HRP試劑或鏈霉親和素-HRP使用的時間是否適當。
不同試劑盒或不同批號的試劑混用。重新檢查試劑的標簽，確準所有組分都屬于正使用的試劑盒中的。不能混用不同試劑盒或不同批號的試劑。
漏加酶檢查操作流程，注意不要漏加
HRP酶污染了疊氮鈉使用新配制的試劑，禁含疊氮鈉
標準品有問題（若在標本孔中有信號）按說明書檢查標準品的制備使用1瓶新標準品
某一容器未洗凈,殘留滅活酶物質(zhì)盡可能用試劑盒內(nèi)容器,另覓一定要潔凈、可靠
使用含血清的緩沖液配制/復溶抗體重新確認所選用的試劑
.漏加顯色劑A或B加顯色劑后觀察一下液面高度
試劑配制/使用有誤將實驗重做；嚴格按說明書操作，每次配制和使用前看清標簽。
緩沖液污染配制新新鮮的緩沖液
顯色弱
超過有效期的產(chǎn)品可能會產(chǎn)生很弱的信號。檢查產(chǎn)品的有效期
加入試劑的體積和時間有誤確定所使用的每一個試劑的體積正確的和加入的時間是適當?shù)摹?BR>試劑、樣品用前未能平衡用前試劑、樣品置室溫平衡10分鐘左右
縮短孵育時間能使實驗的信號變?nèi)酢z查孵育的時間。
在溫度變化的環(huán)境內(nèi)孵育酶標板。確定孵育的溫度，應避免溫度的變化。
使用了被污染的試劑檢查試劑是否被污染。
標準品/標本制備方法不規(guī)范檢查標準品/標本的制備，標準品應按說明書進行復溶和稀釋。低溫貯存的標本避免反復凍融，嚴禁使用溶血標本。樣品用NaN3防腐,抑制了酶的反應
顯色底物制備不規(guī)范檢查底物的制備，如體積是否正確，混合是否恰當充分。
檢測時間不當是否在規(guī)定的時間內(nèi)檢測。
儀器設定不正確，濾光片不匹配。儀器是否設定正確，濾光片的使用等。
高背景（本底）
洗滌操作不規(guī)范洗板不充分，使用手工洗板常出現(xiàn)。使用洗板機，或使用洗瓶洗滌。每孔應*充滿洗滌緩沖液，傾出時應迅速。若使用洗板機，應校準并設定足夠充滿每孔的體積量。板的內(nèi)側不應接觸設備。檢查每孔是否有殘留的洗液或每孔加樣量的體積是否準確。在兩次洗板之間加30秒的浸泡。
實驗中孵育溫度和時間不適當確定每一實驗步驟的孵育溫度和時間是否適當
酶加量過多加酶前驗看移液器調(diào)節(jié)量是否準確。檢查稀釋度，若必要進行效價測定。
封閉不*檢查封閉液的計算量；提高封閉時間。
標本或標準品中的干擾物質(zhì)做適當?shù)膶φ?BR>顯色劑受光照時間較長,或污染顯色劑A和B應于使用*分鐘從冰箱取出
整批樣品放置時間過長,樣品污染樣品應保持新鮮,或低溫保存,防止污染
緩沖液污染制備新鮮的緩沖液
吸頭重復使用,未洗凈或消毒不*而用于加酶或顯色劑吸頭盡可能一次性使用
太多的信號：全部的板子變成規(guī)則的藍色不充分的洗滌/洗滌步驟被遺漏-沒結合的過氧化物酶仍有殘留。使用洗板機充分洗滌檢查孔內(nèi)是否有殘留的洗液或加樣量是否準確。
底物溶液混合太早并轉成藍色應控制底物混合的時機并立即使用
太多的酶結合物檢查稀釋度，必要時進行效價測定
封板膜或試劑容器被重復使用，導致HRP殘留，使TMB底物產(chǎn)生非特異藍色。使用新鮮的封板膜，每步使用不同的試劑容器
緩沖液中污染金屬或HRP制備新鮮緩沖液
高CV值（CV：coefficient of variation），花板
操作不慎或洗滌不充分按說明書洗板、加樣、顯色。洗板尤為重要，如上所述
出現(xiàn)干板，沒有使用封板膜、封板膜重復使用確定每兩步驟間，酶標板應保持濕潤。使用封板膜封口，注意每步使用新鮮的封板膜。
由于操作失誤或板子質(zhì)量差（結合不均勻）造成包板不均勻。稀釋用的PBS中不要加其它蛋白檢查包被和封閉液體積、時間和試劑加入的方法。檢查所使用的酶標板，使用ELISA板子（不要使用組織培養(yǎng)板）
移液器不準確，吸頭重復使用。檢查并校準移液器。每次取樣必須換吸頭。回顧標本的加入步驟，確保每次加樣的準確性，保證吸取的液體按所設定的體積吸入和排出，連續(xù)加樣時注意檢查吸頭，確保所加液體的體積。
樣品離心處理不全,反應孔內(nèi)發(fā)生凝血或殘留細胞成分標本充分離心, 3000rpm 6分以上，嚴禁使用凝血（溶血）的標本
緩沖液污染制備新鮮的緩沖液
標準曲線可得到，但兩點之間區(qū)別很差（低或平的曲線）
酶結合物不足檢查稀釋度，必要時進行效價測定
捕獲抗體沒有很好結合到板上檢查所使用的酶標板，使用ELISA板子（不要使用組織培養(yǎng)板）稀釋用的PBS中不要加其它蛋白
檢測抗體不足檢查稀釋度，必要時進行效價測定
板子顯色不足延長底物孵育實驗使用推薦品牌的底物溶液
操作不慎回顧ELISA操作流程，消除任何擅自修改的程序。
標準曲線稀釋度計算有誤核查計算的情況，制備新的標準曲線
標準曲線很好，但是沒有任何期望的陽性信號產(chǎn)生在標本中無相應的細胞因子使用內(nèi)參對照重復實驗，重新考慮實驗的相應參數(shù)
標本基質(zhì)遮蓋檢測將標本至少做1∶2相應的稀釋，或進行系列稀釋觀測它的恢復性
標準曲線很好，但是標本的判讀值很高標本中含的細胞因子水平超過實驗范圍將標本做稀釋并再次實驗
當使用HRP酶結合物時，TMB底物加終止液后顯綠色孔中的試劑顯色不充分輕輕振蕩板子
邊緣效應
工作環(huán)境溫度不均衡避免將板子在變化溫度環(huán)境中孵育
漂移
實驗過程中出現(xiàn)間斷整個實驗應連續(xù)操作：在實驗開始前將所有標準品和標本做適當?shù)臏蕚?BR>試劑沒有按說明書平衡至室溫在所有試劑加入孔前，確保它們已平衡至室溫，除非說明書中有另外的要求。
是否可更改試劑盒  所提供的實驗操作步驟？
一般廠商為確保zui高的靈敏度和特異性，對試劑盒都進行了優(yōu)化，為確保每一試劑盒實驗的規(guī)范性應按說明書操作。
是否可混用不同試劑盒中的試劑？
不行。絕大多數(shù)試劑在每批試劑盒中是特異的，若有問題可與廠家或代理商。
是否可增加或減少標本的體積。
商品化的試劑盒所需加入的標本體積是優(yōu)化的，應按說明書操作，不建議更改所加標本的體積。
是否可重確定自己的標準曲線的點？
可以。說明書上有建議的制備標準曲線時標準品的稀釋度，可改變稀釋倍數(shù)和增加曲線的點，但是必須在實驗范圍內(nèi)，高于試劑盒中zui高標準品的點和低于靈敏度以下的點是無效的。