WB實(shí)驗(yàn)代測(cè)基本過(guò)程

更新時(shí)間：2015-04-28

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　　1 、獲取細(xì)胞或組織裂解物

　　1）根據(jù)檢測(cè)蛋白的位置選擇合適的裂解buffer；

　　2）選擇合適的蛋白酶抑制劑，避免蛋白降解，從而保證檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

　　2 、蛋白定量

　　3 、電泳分離蛋白質(zhì)

　　4 、轉(zhuǎn)膜：根據(jù)不同的檢測(cè)目的和待測(cè)蛋白的特性,選擇合適的膜類(lèi)型。

　　5 、封閉：去掉膜上多余的非特異性結(jié)合位點(diǎn)，降低背景。

　　6 、一抗孵育

　　一抗的選擇成功與否，是整個(gè)WB實(shí)驗(yàn)代測(cè)成功的關(guān)鍵，選擇一抗有以下幾個(gè)注意點(diǎn)：

　　1）選擇適合檢測(cè)標(biāo)本種屬的一抗；

　　2）選擇適用于WB實(shí)驗(yàn)方法的一抗；

　　3）選擇單克隆抗體或者經(jīng)過(guò)親和純化的多克隆抗體。

　　7 、二抗孵育：孵育條件一般為室溫1-2小時(shí)。

　　8 、底物孵育：選擇顯色或者化學(xué)發(fā)光底物。一般傾向于化學(xué)發(fā)光，靈敏度高且背景低，節(jié)省抗體用量。

　　9 、結(jié)果分析和檢測(cè)：凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)或者暗室曝光到膠片。

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