PRODUCT CLASSIFICATION
產(chǎn)品分類技術(shù)文章/ Technical Articles
植物過(guò)氧化物酶(POD)檢測(cè)試劑盒(愈創(chuàng)木酚微板法)的計(jì)算
產(chǎn)品簡(jiǎn)介:
過(guò)氧化物酶(peroxisome,POD)是以過(guò)氧化氫為電子受體催化底物氧化的酶,主要存在于細(xì)胞的過(guò)氧化物酶體中,以鐵卟啉為輔基,可催化過(guò)氧化氫,氧化酚類和胺類化合物,具有消除過(guò)氧化氫和酚類、胺類毒性的雙重作用,該酶屬于細(xì)胞木質(zhì)素合成途徑中間的關(guān)鍵酶,研究該酶可以探討多種生物細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中木質(zhì)素沉積的代謝機(jī)理,為減少水果石細(xì)胞含量提高其品質(zhì)提供依據(jù)。植物過(guò)氧化物酶(POD)檢測(cè)試劑盒(愈創(chuàng)木酚微板法)檢測(cè)原理是以愈創(chuàng)木酚(又稱 2-甲氧基酚)作為底物,在酶促反應(yīng)的最適條件下采用每隔一定時(shí)間測(cè)定產(chǎn)物生成量的方法,于酶標(biāo)儀 470nm 處測(cè)定吸光度,以吸光度變化所需酶量進(jìn)行計(jì)算,主要用于植物組織的裂解液或勻漿液、血清等樣品中內(nèi)源性的過(guò)氧化物酶活性,尤其適用于測(cè)定水果中過(guò)氧化物酶活性。該試劑盒僅用于科研領(lǐng)域,不適用于臨床診斷或其他用途。
自備材料:
1、蒸餾水
2、研缽或勻漿器
3、離心管
4、低溫離心機(jī)
5、水浴鍋或恒溫箱
6、96 孔板、酶標(biāo)儀
操作步驟(僅供參考):
1、準(zhǔn)備樣品:
①植物樣品:取 0.5-1.0g 植物組織或水果中層果肉加入 4ml 預(yù)冷的 POD Lysis Buffer
研磨或勻漿,4℃ 10000g 離心 15~20min,留取上清液,即為 POD 粗提液,-20℃凍
存,用于過(guò)氧化物酶的測(cè)定。
②血漿、血清和尿液樣品:血漿、血清按照常規(guī)方法制備后可以直接用于該試劑盒的測(cè)定,-20℃凍存,用于過(guò)氧化物酶的測(cè)定。
③細(xì)胞或組織樣品:取恰當(dāng)細(xì)胞或組織裂解液,如有必要用 POD Lysis Buffer 進(jìn)行適當(dāng)勻漿,4℃ 10000g 離心 15~20min,留取上清液,即為 POD 粗提液,-20℃凍存,用于過(guò)氧化物酶的測(cè)定。
④高活性樣品:如果樣品中含有較高活性的過(guò)氧化物酶,可以使用 POD Lysis Buffer 進(jìn)行恰當(dāng)?shù)南♂尅?/span>
2、配制 POD Assay Buffer 工作液:取適量的 POD 氧化劑和 POD Assay Buffer,按 POD氧化劑:POD Assay Buffer=1:14 混合,即為 POD Assay Buffer 工作液,即配即用,不宜久置。
3、POD 加樣:取 96 孔板,按照下表設(shè)置對(duì)照孔孔、測(cè)定孔,注意:對(duì)照孔、測(cè)定孔中為同一待測(cè)樣品,但對(duì)照孔中是提前加熱煮沸 5min 的樣品;溶液應(yīng)按照順序依次加入,并注意避免產(chǎn)生氣泡,如果樣品中的 POD 活性過(guò)高,可以減少樣品用量或適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測(cè)定,樣品的檢測(cè)最好能設(shè)置 2 平行孔,求平均值。
4、POD 測(cè)定:立即以酶標(biāo)儀,以對(duì)照孔為對(duì)照,測(cè)定 470nm 處測(cè)定孔的吸光度(A 測(cè)定 0);
37℃準(zhǔn)確孵育 3min 后,立即加入 5μl POD 終止液終止反應(yīng)(備選方案),以對(duì)照孔為對(duì)
照,以酶標(biāo)儀測(cè)定 470nm 處測(cè)定孔的吸光度(A 測(cè)定 1)。注意:加入 POD 終止液終止反
應(yīng)不是必須步驟,可 37℃準(zhǔn)確孵育 3min 后,以對(duì)照孔為對(duì)照,直接以酶標(biāo)儀測(cè)470nm 處測(cè)定孔的吸光度(A 測(cè)定 1)。
計(jì)算:
POD 活性單位的定義:在該實(shí)驗(yàn)條件下,每 1min 吸光度變化 0.01 所需酶量為一個(gè)活
性單位。
組織樣本 POD(U)={(A 測(cè)定 1-A 測(cè)定 0)×VT}/(W×VS×0.01×t)
式中:A 測(cè)定 1=孵育 3min 后測(cè)定孔的吸光度值
A 測(cè)定 0=加入 POD Assay buffer 工作液后測(cè)定孔的吸光度值
W=組織樣本的重量(g)
VT=提取酶液的總體積(ml)
VS=測(cè)定時(shí)所用酶液體積(ml)
t=反應(yīng)時(shí)間
液體樣本 POD(U)=(A 測(cè)定 1-A 測(cè)定 0)/(0.01×t)
式中:A 測(cè)定 1=孵育 3min 后測(cè)定孔的吸光度值
A 測(cè)定 0=加入 POD Assay buffer 工作液后立即測(cè)定的測(cè)定孔吸光度值
t=反應(yīng)時(shí)間
注意事項(xiàng):
1、 待測(cè)樣品中不能含有酶抑制劑,同時(shí)需避免反復(fù)凍融。
2、 POD 酶液提取時(shí),注意低溫操作,防止酶活性。
3、 以煮沸的酶液為對(duì)照時(shí),酶要充分失活。
4、 POD 氧化劑和 POD 終止液具有一定腐蝕性,請(qǐng)小心操作。
5、 POD 氧化劑易揮發(fā),請(qǐng)密閉保存,否則檢測(cè)效率下降。
6、 如果沒有酶標(biāo)儀,也可以使用普通的分光光度計(jì)測(cè)定,每次檢測(cè)指標(biāo)不宜過(guò)多,否則操作時(shí)間不一,有可能導(dǎo)致樣本間的差異。
7、 為了您的安全和健康,請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
有效期:6 個(gè)月有效;常溫運(yùn)輸,4℃保存。
植物過(guò)氧化物酶(POD)檢測(cè)試劑盒(愈創(chuàng)木酚微板法)的計(jì)算
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