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elisa試劑盒和生化試劑盒該如何選擇和評(píng)判

更新時(shí)間:2018-07-26      瀏覽次數(shù):5948

   隨著電子檢驗(yàn)儀器的研制和普遍使用,推動(dòng)了科研診斷試劑研究和使用廣泛化的進(jìn)程,商品試劑與標(biāo)準(zhǔn)液按檢測(cè)項(xiàng)目組合成一套放在一個(gè)包裝盒內(nèi)叫試劑盒(reagent kit),或叫試劑組合(reagent set)。

   與自動(dòng)化分析儀或者酶標(biāo)儀匹配的試劑盒的研制、生物試劑和供應(yīng)走向產(chǎn)業(yè)化的道路,它無疑是科研檢驗(yàn)發(fā)展*一個(gè)巨大的技術(shù)進(jìn)步。但是,試劑盒的質(zhì)量,將嚴(yán)重影響測(cè)定結(jié)果的正確性。為了增強(qiáng)識(shí)別試劑質(zhì)量的能力,提高拒用劣質(zhì)試劑的自覺性,掌握有關(guān)試劑盒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量評(píng)價(jià)是十分有益的。

   我們先來說說和自動(dòng)生化分析儀想匹配的生化分析試劑盒的相關(guān)情況。此類試劑種類繁多,有液體型、粉劑型、片劑型,有單一試劑、雙試劑、干試劑、多試劑等。

一、液體型試劑和粉(片)劑型試劑

 

(一)液體型試劑

無論是單試劑還是雙試劑型試劑,目前乃至今后仍以液體型為主要?jiǎng)┬汀F鋬?yōu)點(diǎn)是液體型試劑

的試劑組分高度均一,瓶間差異小,測(cè)定重復(fù)性好和使用方便;它也無需加入任何輔助試劑及蒸餾

水,避免了外源性水質(zhì)對(duì)試劑的影響,性能較穩(wěn)定,測(cè)定結(jié)果較為準(zhǔn)確。缺點(diǎn)是液體型試劑(尤其

是酶試劑)保存時(shí)間較短,不便于運(yùn)輸。

1.液體單試劑        

所謂液體單試劑就是將某種生化檢驗(yàn)項(xiàng)目所用到的試劑科學(xué)地混合在一起,

組成為一種試劑。應(yīng)用時(shí),只須將標(biāo)本和試劑按一定比例混合,即可進(jìn)行相應(yīng)的生化反應(yīng),然后用

適當(dāng)?shù)姆椒z測(cè)結(jié)果。應(yīng)用十分方便。為了簡(jiǎn)化測(cè)定操作程序,提高工作效率,一度大多數(shù)試劑廠

家都生物試劑單試劑,以滿足用戶的需要。如測(cè)定葡萄糖和膽固醇的酶法試劑等。這些試劑的廣泛使用,

充分顯示出酶法試劑無毒性、操作簡(jiǎn)便快速、測(cè)定結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)。但對(duì)有些生化檢驗(yàn)項(xiàng)目來說,

單試劑存在抗干擾能力差的缺點(diǎn),給測(cè)定結(jié)果帶來相當(dāng)大的分析誤差。例如,甘油三酯測(cè)定的一步

法試劑,由于未消除樣品中的游離甘油,使測(cè)定結(jié)果中包括了內(nèi)源性甘油(平均約為 0.11mmol/L),會(huì)給甘油三酯的測(cè)定值帶來較大的誤差。類似的情況還見于維生素C和尿酸及膽紅素對(duì)Trinder+選用時(shí)值得注意。

2.液體雙試劑       所謂液體雙試劑就是將某些生化檢測(cè)項(xiàng)目所用到的試劑,按用途科學(xué)地分成兩類,分別配成兩種試劑,通常試劑加入后可起到全部或部分消除某些內(nèi)源性干擾的作用,第二試劑為啟動(dòng)被檢測(cè)物質(zhì)反應(yīng)的試劑,兩種試劑混合后才共同完成被檢項(xiàng)目的生化反應(yīng)。然后用適當(dāng)?shù)姆椒z測(cè)結(jié)果。雙試劑型試劑盒,它保持了單試劑的優(yōu)點(diǎn),增強(qiáng)了抗干擾能力和試劑的穩(wěn)定性,提高了測(cè)定的準(zhǔn)確性,代表了診斷試劑盒劑型研制的主要發(fā)展方向。

(二)粉(片)劑型試劑

所謂粉劑型及片劑型試劑,即是將試劑的各組分用球磨技術(shù)粉碎成粉劑或混合后壓成片劑,使

用前再加入的溶液復(fù)溶成液體試劑。干粉試劑如果在凍干分裝前是液體型的,則其各組分是相

當(dāng)均勻的;但如果用固體原料研磨后制成粉劑或片劑,則存在許多問題:①要使試劑各組分混合得

非常均勻,技術(shù)難度很大;②分裝過程中的稱量誤差及復(fù)溶時(shí)加水量的準(zhǔn)確性影響試劑的瓶間差;

③水質(zhì)優(yōu)劣對(duì)試劑的穩(wěn)定性和測(cè)定的可靠性有相當(dāng)大的影響。

 

二、其它類型試劑

 

為了適應(yīng)生化分析儀和測(cè)定方法學(xué)的進(jìn)步,近年來研究了許多新型的試劑盒,主要有以下幾種。

(一)快速反應(yīng)試劑盒

快速反應(yīng)試劑盒主要是為了適應(yīng)生化分析的技術(shù)進(jìn)步,縮短反應(yīng)時(shí)間,提高工作效率。如血液

葡萄糖快速測(cè)定試劑盒。其試劑成分及濃度為磷酸鹽緩沖液  100mmol/  L,pH7.4±0.1,葡萄糖氧

化酶  > 40u / ml,變旋酶  > 0.2u / ml,過氧化物酶  > 2.5u / ml,4-氨基安替比林 0.5 mmol/ L,

4-羥基苯甲酸 4  mmol/L,亞鐵qing化鉀 1mg  /  L,疊氮鈉 0.4g  /  L。同一般葡萄糖氧化酶法試劑相

比是明顯增加了葡萄糖氧化酶及過氧化物酶用量,更主要是增加了變旋酶,可使反應(yīng)加快,3~4

分鐘后即生成終顏色。再如快速膽固醇試劑盒,用的是 pH6.6±0.2,250mmol/ L 磷酸鹽緩沖液,

膽固醇酯酶為 250u / L,膽固醇氧化酶 250 u/L,過氧化物酶 4000u / L,4-氨基安替比林 0.3mg /

L,DHBS      8mmol/  L。樣品與試劑比例是 1:100。37℃反應(yīng) 2 分鐘即可完成反應(yīng)。可以明顯看出是

加大膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶等效應(yīng)酶用量,從而使反應(yīng)加速。目前要求這種快速反應(yīng)的試劑用

戶還不多,但它是一種發(fā)展趨勢(shì)。

(二)一步法試劑盒

這是隨著方法學(xué)的改進(jìn),特別是免疫技術(shù)的進(jìn)步,利用特異性抗體參與反應(yīng)的新型試劑。如高

密度脂蛋白(HDL)測(cè)定。以往多采用超速離心法和沉淀法使 HDL 從其他脂蛋白中分離后再測(cè)定 HDL中膽固醇,沉淀法操作繁瑣,必須預(yù)先處理才能用生化分析儀分析。近年來采用抗低密度脂蛋白和極低密度脂蛋白血清預(yù)先抑制 LDL 及 VLDL,然后再測(cè)定 HDL,這樣就減少沉淀預(yù)處理,直接測(cè)定出高密度膽固醇。類似的試劑盒還有肌酸激酶(CK)及其同工酶 CK-MB 的測(cè)定。

(三)多項(xiàng)同測(cè)組合試劑盒

這類型試劑主要是用于三點(diǎn)雙項(xiàng)同測(cè)終點(diǎn)法、三點(diǎn)雙項(xiàng)同測(cè)連續(xù)監(jiān)測(cè)法和三點(diǎn)雙項(xiàng)同測(cè)終點(diǎn)速

率法測(cè)定的試劑盒。很明顯這類試劑同以往單試劑和雙試劑有明顯不同。隨著雙試劑的應(yīng)用,研究

生化分析儀的分析方法也相應(yīng)發(fā)展,其中有一種分析方法是在同一比色杯中,先后加入兩種試劑與

檢品中的兩種被檢物發(fā)生反應(yīng),在各反應(yīng)達(dá)到平衡期時(shí)分別測(cè)定,整個(gè)測(cè)定過程進(jìn)行三次比色,測(cè)

定兩個(gè)項(xiàng)目,稱為三點(diǎn)雙項(xiàng)同測(cè)終點(diǎn)法。例如甘油三脂、膽固醇同時(shí)測(cè)定法。該法的試劑為

Tris 緩沖液,含膽固醇酯酶、ATP、MgCl2、過氧化物酶、磷酸甘油氧化酶、甘油激酶、脂肪酶、4-

氨基安替吡啉、2-羥 3.5-氯苯磺酸鈉、Triton-X 等,第二試劑為 Tris 緩沖液,其中含膽固醇氧化酶。當(dāng)血清或標(biāo)準(zhǔn)液(包括甘油三酯和膽固醇)與試劑混合后立即進(jìn)行次比色(510nm)

得空白吸光度。37℃作用 5 分鐘后進(jìn)行第二次比色,為甘油三酯與酶試劑反應(yīng)終點(diǎn)的吸光度,又是

膽固醇測(cè)定的空白吸光度。然后加入第二試劑,37℃作用 5~10 分鐘,進(jìn)行第三次比色,為膽固醇

與酶試劑反應(yīng)終點(diǎn)的吸光度。

甘油三酯濃度=[A2(樣品)-AB(樣品)]/[A2(TG  標(biāo)準(zhǔn))-AB(TG  標(biāo)準(zhǔn))]×甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)的濃度

總膽固醇濃度=[A3(樣品)-A2(樣品)]/[A3(TC  標(biāo)準(zhǔn))-A2(TC  標(biāo)準(zhǔn))]×膽固醇標(biāo)準(zhǔn)的濃度

(四)卡式試劑盒

試劑首先裝入試劑瓶,瓶上充分使用編碼技術(shù),而后根據(jù)編碼啟動(dòng)調(diào)配、使用及更換儲(chǔ)存。其

特點(diǎn)是:①卡式試劑瓶上條碼令使用者可快捷準(zhǔn)確地輸入試劑數(shù)據(jù),如測(cè)試數(shù)量、批號(hào)、有效期,

保證正確識(shí)別試劑。②試劑裝載后能自動(dòng)調(diào)配,可消除潛在誤差,并節(jié)省操作時(shí)間。③持續(xù)不斷地

監(jiān)察儀器上已裝載的試劑存量,并在供應(yīng)量不足時(shí)通知使用者。試劑裝載使用時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)一個(gè)月。

④所有卡式試劑盒大小劃一,有利儲(chǔ)存。卡式試劑設(shè)計(jì)較*,可防止試劑蒸發(fā)及降解,能確保試

劑裝載后的穩(wěn)定性更長(zhǎng),從而節(jié)省成本。⑤標(biāo)簽根據(jù)測(cè)試類別以顏色編碼,便于使用者識(shí)別。

(五)濃縮試劑盒

上述卡式試劑盒就是采用的濃縮試劑,使用時(shí)自動(dòng)完成稀釋,而后用于測(cè)定。濃縮試劑便于工

作、儲(chǔ)存、運(yùn)輸、裝載等*性是很明顯的,濃縮試劑便于監(jiān)控、減少校正次數(shù)、提高工作質(zhì)量。

在濃縮試劑基礎(chǔ)上又組成雙試劑及多項(xiàng)同測(cè)組合試劑,又體現(xiàn)出它們所具有的特點(diǎn)及*性。

三、液體雙試劑盒的特點(diǎn)

液體雙試劑與其它類型試劑比較具有液體試劑和雙試劑的優(yōu)點(diǎn)。

(一)提高了抗干擾反應(yīng)的能力

在研究生化測(cè)定過程中,血標(biāo)本除了含有待測(cè)物質(zhì)外,還含有各種酶、有機(jī)物、無機(jī)鹽等物質(zhì),

這些物質(zhì)都會(huì)干擾或參與測(cè)試反應(yīng),引起非特異性反應(yīng)干擾,而雙試劑型試劑盒設(shè)計(jì)的一個(gè)主要目

的就是為了克服這種干擾反應(yīng)。在測(cè)定過程中,首先讓試劑Ⅰ與標(biāo)本中的干擾物質(zhì)反應(yīng),反應(yīng)  5

分鐘后,再用試劑Ⅱ啟動(dòng)真正的測(cè)試反應(yīng),從而使測(cè)定結(jié)果更加準(zhǔn)確。

例如:尿素氮的酶法測(cè)定。此測(cè)定通過二步化學(xué)反應(yīng)來完成。

在 340nm 下監(jiān)測(cè)吸光度值的變化,與同樣處理的尿素標(biāo)準(zhǔn)液比較,計(jì)算出樣品尿素含量。這

一反應(yīng)的步特異性高,脲酶只對(duì)樣品中的尿素起催化作用,但第二步反應(yīng)就存在一些干擾:樣

品中(如血清、尿液)含有 NH4,(內(nèi)源性 NH4)會(huì)消耗 NADH,使測(cè)定結(jié)果偏高;復(fù)溶試劑時(shí)所

用蒸餾水如果含有 NH4 或者所用器材不夠清潔被 NH4 污染(外源性 NH4)也會(huì)消耗 NADH,使測(cè)

定結(jié)果偏高;當(dāng)樣品中(如血清)含有較高的丙酮酸時(shí),血清中的乳酸脫氫酶會(huì)催化下列反應(yīng):

LDH

 

單一試劑型試劑測(cè)定尿素時(shí)存在內(nèi)源性 NH4、外源性 NH4 和內(nèi)源性丙酮酸的干擾,使測(cè)定結(jié)果產(chǎn)

生正誤差。

測(cè)定尿素的酶法雙試劑(液體型)試劑盒有兩個(gè)試劑,均為液體,不必復(fù)溶。試劑含α—

酮戊二酸、NADH、谷氨酸脫氫酶及維持 pH 的緩沖物質(zhì)。第二試劑含脲酶、NADH、α—酮戊二

酸。當(dāng)被檢樣品加入試劑在 37℃作用 5 分鐘,將內(nèi)源 NH4、外源性 NH4 及內(nèi)源性丙酮酸消耗 。 接 著 加 入 第 二 試 劑 使 樣 品 中 的 尿 素 被 脲 酶 水 解 成   NH4 , 再 進(jìn) 行 第 二 步 反 應(yīng) ,

GLDH

 

了尿素測(cè)定的準(zhǔn)確性。

再如:目前在研究化學(xué)檢測(cè)中用的較為普遍的指示反應(yīng) Trinder 反應(yīng)(主要用于代謝產(chǎn)物的測(cè)

定,如葡萄糖、尿酸、甘油三脂、膽固醇、HDL),此指示反應(yīng)的特異性較差,受到血標(biāo)本中的膽

紅素、抗壞血酸的干擾,導(dǎo)致結(jié)果的陰性偏差。其中為了克服膽紅素的干擾,國(guó)內(nèi)外部分試劑已通

過加入鐵qing化鉀、調(diào)整顯色劑改變測(cè)定波長(zhǎng)來排除膽紅素的干擾,而抗壞血酸的影響和干擾一直較

難克服,從面影響了測(cè)定結(jié)果。液體雙試劑(包括甘油三脂、膽固醇、HDL、尿酸、肌酐)在試

劑 I 中加入了抗壞血酸氧化酶,當(dāng)標(biāo)本和試劑 I 先反應(yīng),便可克服標(biāo)本抗壞血酸的干擾,當(dāng)抗干擾

反應(yīng)完畢后,再加入試劑Ⅱ啟動(dòng)反應(yīng),從而使得整個(gè)反應(yīng)的特異性大大提高,準(zhǔn)確度也相應(yīng)提高。

 

 

另外,常見的干擾是黃疸。有的測(cè)定試劑中加有膽紅素氧化酶,先作用黃疸血清使其氧化無

 

色,而后再加反應(yīng)試劑完成反應(yīng)測(cè)定,消除黃疸的影響。

(二)使測(cè)定更科學(xué)合理

由于液體雙試劑的使用,使測(cè)定更加科學(xué)合理。如

LP

 

GK

 

GPO

 

POD

 

目前國(guó)內(nèi)研究生化檢驗(yàn)使用的生化試劑絕大多數(shù)都是單一試劑,在甘油三脂測(cè)定中測(cè)得甘油三

脂的含量實(shí)際上是標(biāo)本中甘油三脂與游離甘油的總含量,盡管研究上可以通過減去標(biāo)本中平均游離

甘油的含量和修改正常范圍加以彌補(bǔ),但是,由于研究標(biāo)本的個(gè)體差異,使得血標(biāo)本中游離甘油的

含量不可能都一樣。而液體雙試劑可先讓標(biāo)本與試劑 I 反應(yīng)(試劑 I 中包括甘油激酶、抗壞血酸氧

化酶、甘油—3—磷酸氧化酶、過氧化物酶),從而*消耗標(biāo)本中游離甘油,排除抗壞血酸的干擾,

然后再用試劑Ⅱ含有 LP 和發(fā)色團(tuán)啟動(dòng)反應(yīng),使得測(cè)得的結(jié)果真正反映標(biāo)本中甘油三脂的含量。

(三)穩(wěn)定性能優(yōu)良

目前研究化學(xué)檢定的許多項(xiàng)目都已用酶法進(jìn)行測(cè)定,這些酶法測(cè)定與以往化學(xué)測(cè)定法相比具有

*的*性:①特異性高;②試劑單一,操作步驟簡(jiǎn)單,可自動(dòng)操作;③反應(yīng)溫和,無污染

等。但是酶法生化商品試劑生物試劑的大技術(shù)障礙便是試劑的穩(wěn)定性問題,為此許多試劑生物試劑廠家推

出了凍干、干粉、片劑的酶法試劑,從而解決了成品貯存與運(yùn)輸問題,然而在使用過程中仍然受到

了復(fù)溶后穩(wěn)定性的影響,各實(shí)驗(yàn)室在使用中如果包裝太大,復(fù)溶后穩(wěn)定期過后便會(huì)造成浪費(fèi),如果

包裝太小,本身價(jià)格太高,造成日常化驗(yàn)成本居高不下。全液體酶法試劑從分配上解決了這一矛盾:

①用戶可根據(jù)每次標(biāo)本量多少按一定比例配制適量工作液,當(dāng)天配制當(dāng)天用完,這樣便可減少試劑

損失。②如果用戶使用的自動(dòng)生化分析儀有雙試劑測(cè)定功能,那么,就不必把雙試劑混合成工作試

劑進(jìn)行測(cè)定,試劑的有效期一年便是工作液的有效期。

對(duì)于干粉、片劑型等需復(fù)溶的生化試劑,水質(zhì)的好與壞直接影響了復(fù)溶后工作液的穩(wěn)定性和測(cè)

定重復(fù)性。目前除了一些大城市的三級(jí)醫(yī)院有自制的試劑級(jí)的蒸餾水外,別的醫(yī)院很難獲得符合試

劑級(jí)要求的水,這就對(duì)干粉、片劑試劑的實(shí)際使用造成了一定影響。目前研究化學(xué)檢測(cè)中許多項(xiàng)目

已經(jīng)開始用酶法進(jìn)行分析測(cè)定,而試劑中許多酶在水溶液中是比較“脆弱”的,許多雜質(zhì)都會(huì)影響

酶活力,如①水中  F  會(huì)引起某些酶失活;②水中的重金屬離子會(huì)影響酶活力;③水中某些微生物

會(huì)引起酶失活,除了水中某些“雜質(zhì)”會(huì)引起試劑中酶失活、部分失活而導(dǎo)致穩(wěn)定性、重復(fù)性下降

外,有些“雜質(zhì)”會(huì)直接影響測(cè)定結(jié)查,如水中含有 NH4 便會(huì)直接影響尿素氮測(cè)定的準(zhǔn)確度。全

液體型生化試劑,在使用過程無需任何輔助試劑及蒸餾水,這就保證避免了外源水質(zhì)而引起的對(duì)試

劑的影響,保證了試劑在有效期內(nèi)的穩(wěn)定和測(cè)定結(jié)果的可靠。

(四)試劑組分高度均一

試劑中每一組分均一性是影響試劑測(cè)定重復(fù)性的一個(gè)重要因素。在干粉、片劑與凍干生化試劑

生物試劑過程要使每一試劑中十幾種組分(有的組分含量相當(dāng)微量)分布相對(duì)均勻也是一個(gè)技術(shù)難度較

高的課題。在每一種試劑生物試劑過程中必須解決:①原料干粉生物試劑過程中每一組分的均勻性(凍干生

化試劑在凍干分裝前由于是液體的,每個(gè)組分是相當(dāng)均勻)。②在分裝過程中由于加樣誤差引起的

均勻性問題(這一問題在凍干分裝過程中同樣存在:在片劑生物試劑過程中體現(xiàn)為每一片劑重量誤差)。

③在使用過程中,由于需加入復(fù)溶水,復(fù)溶水的加樣誤差也會(huì)造成瓶與瓶之間同一組分濃度不盡一

樣。上述三個(gè)原因或其中一個(gè)原因都會(huì)造成實(shí)際測(cè)定過程中的瓶間誤差,從而引起測(cè)定重復(fù)性下降。

液體型的生化試劑從生物試劑到使用全是液態(tài),這就保證了每一個(gè)組分相對(duì)均勻,哪怕是十分微量的組

分,這就避免了實(shí)際操作中的誤差,能提高試劑測(cè)定的重復(fù)性。

 

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