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產(chǎn)品分類信帆生物手把手教你做Real-time qPCR實驗
Real-time qPCR實驗設計
實驗設計其實比實驗本身更重要!好的實驗設計可以事半功倍,節(jié)省時間!尤其做生物實驗,一定要查詢盡可能*的相關(guān)資料,整理好思路,設計好實驗路線。當然實驗過程中出現(xiàn)各種各樣的變化,但有足夠多的背景知識,就可以分析原因,才有可能創(chuàng)新。對于一個real-time qPCR而言,首先就是實驗材料的處理和準備;然后引物設計,這步至關(guān)重要,好的引物是實驗本身成功的50%;進行實驗和數(shù)據(jù)分析(這一部分單獨說明)。
1. 實驗材料的處理和準備
以zui基本的基因表達差異分析為例。實驗材料分為對照組(CON)和處理組(TRT)。組內(nèi)要有生物重復,可以數(shù)據(jù)分析此處理是否有統(tǒng)計意義。在材料收集過程中,盡量避免RNA的降解(尤其對于定量的樣品)。
一般傳統(tǒng)的收集材料的方法是樣品采集立刻液氮速凍,然后迅速轉(zhuǎn)移到超低溫冰箱保存,但這種方法攜帶不方便,由于對于異地取材。現(xiàn)在新技術(shù)的發(fā)展,也有一些非液氮類的樣品儲存液 ,比如百泰克的RNAfixer 。
2. 引物設計
一般real-time PCR引物的設計遵循下面一些原則:
擴增產(chǎn)物長度在80-150bp。
引物應用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設計并具有特異性。
產(chǎn)物不能形成二級結(jié)構(gòu)。
產(chǎn)物長度一般在15-30堿基之間。
G+C含量在40%-60%之間。
堿基要隨機分布。
引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補。
引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補。
引物5’端可以修飾。
引物3’端不可修飾。
引物3’端要避開密碼子的第3位。
Taqman@探針的設計稍有不同,一般有公司設計合成。遵循下面以下原則:
盡量靠在上游引物;
長度30-45bp,Tm比引物高至少5℃;
5’端不要是G,G會有淬滅作用,影響定量
信帆生物手把手教你做Real-time qPCR實驗
Real-time qPCR操作過程
1. RNA提取和反轉(zhuǎn)錄
在抽提RNA過程中任一環(huán)節(jié)的不正確操作都可能導致RNA酶的污染。由于RNA酶的活性很難*抑制,預防其污染是十分必要的。在實際的操作中應遵循下面一些原則:
(1)全程佩戴一次性手套。皮膚經(jīng)常帶有細菌和霉菌,可能污染RNA的抽提并成為RNA酶的來源。培養(yǎng)良好的微生物實驗操作習慣預防微生物污染。
(2)使用滅菌的,一次性的塑料器皿和自動吸管抽提RNA,避免使用公共儀器所導致的RNA酶交叉污染。例如,使用RNA探針的實驗室可能用RNA酶A或T1來降低濾紙上的背景,因而某些非一次性的物品(如自動吸管)可能富含RNA酶。
(3)在提取裂解液中,RNA是隔離在RNA酶污染之外的。而對樣品的后續(xù)操作會要求用無RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150°C的烘箱中烘烤4小時。塑料器皿可以在0.5M NaOH中浸泡10分鐘,用水*漂洗干凈后高壓滅菌備用。
當然,這些也不是的要求。如果是操作熟練。*可以用初次開封的離心管和槍頭,新過濾的超純水,進行RNA的提取。
2. Mix配制
一般來講,進行real-time qPCR MasterMix都是2×的濃縮液,只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR靈敏度高,所以每個樣品至少要做3個平行孔,以防在后面的數(shù)據(jù)分析中,由于Ct相差較多或者SD太大,無法進行統(tǒng)計分析。通常來講,反應體系的引物終濃度為100-400mM;模板如果是總RNA一般是10ng-500,如果cDNA,通常情況下是1ul或者1ul的10倍稀釋液,要根據(jù)目的基因的表達豐度進行調(diào)整。當然這些都是經(jīng)驗值,在操作過程中,還需要根據(jù)所用MasterMix,模板和引物的不同進行優(yōu)化,達到一個*反應體系。在反應體系配置過程中,有下面幾點需要注意:
(1)MasterMix不要反復凍融,如果經(jīng)常使用,溶解后放在4度。
(2)更多的配制Mix進行,減少加樣誤差。能在冰上操作。
(3)每管或每孔都要換新槍頭!不要連續(xù)用同一個槍頭加樣!
(4)所有成分加完后,離心去除氣泡。
(5)每個樣品至少3個平行孔。
參比或者校正染料(reference dye,passive dye)常用的是ROXTM(現(xiàn)在已經(jīng)是ABI的注冊商標了!)或者其他染料,只要不影響檢測PCR產(chǎn)物的熒光值就可以。參比染料的作用是標準化熒光定量反應中的非PCR震蕩,校正加樣誤差或者是孔與孔之間的誤差,提供一個穩(wěn)定的基線。現(xiàn)在很多公司已經(jīng)把ROXTM配制在MasterMix或者Premixture里。如果反應曲線良好或已經(jīng)優(yōu)化好反應體系,也可以不加ROXTM染料校正。
通常來講,real-time qPCR的反應程序不需要像常規(guī)的PCR那樣,要變性、退火、延伸3步。由于其產(chǎn)物長度在80-150bp 之間,所以只需要變性和退火就可以了。SYBR@Green等染料法,在PCR擴增程序結(jié)束后,加一個溶解程序,來形成溶解曲線,判斷PCR產(chǎn)物的特異性擴增。而溶解程序,儀器都有默認設置,或稍有不同,但都是一個在產(chǎn)物進行溶解時候,進行熒光信號的收集。
3. 儀器設置
所有儀器的操作都基本一致。設置的時候包括反應板設置(plate setup)和程序設置(program setup)。我們以 ABI StepOne為例,詳細看一下反應設置:
A. 首先是實驗目的選擇:定量還是其他。我們命名為“BioTeke”,進行“定量”實驗。
B. 實驗方法的選擇:我們選用的比較Ct的SYBR Green方法, Fast程序,以cDNA為模板進行。
C. 目的基因的設置:有幾個目的基因和目的基因的名稱。
D. 樣品的設置:包括哪個是實驗組,哪個是對照組。以及負對照的設置和生物重復的設置。
E. 對照組和內(nèi)參基因的設置:這個是為后面的定量做準備
F. 反應程序的設置:PCR反應程序的設置要根據(jù)不同公司的MasterMix。比如BioTeke的95℃ 2分鐘就可以激活DNA聚合酶(ABI的需要10 分鐘)。循環(huán)反應是95℃15秒,60℃15秒的40個循環(huán)。溶解曲線程序采用儀器默認設置就可以。或者是儀器說明書上建議的程序。
G. 反應體系的設置:
A-G這五個步驟簡單設置好,可以保存,修改反應程序或者立刻進行反應。需要注意一點ABI儀器需要加ROX參比染料,默認的是ROX。有些公司是把ROX或者其他染料配制在MasteMix里面;也有的是單獨分開。要根據(jù)不同公司的MasterMix進行這一個步驟的選擇。BioTeke的MasterMix里沒有參比染料,所以選擇“none”。設置好之后,就可以把配置好的PCR管放進儀器,點擊RUN!
Real-time qPCR數(shù)據(jù)分析
1. Real-time qPCR常見參數(shù)
基線(baseline)
通常是3-15個循環(huán)的熒光信號
同一次反應中針對不同的基因需單獨設置基線
閾值(threshold)
自動設置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍
手動設置:置于指數(shù)擴增期,剛好可以清楚地看到熒光信號明顯增強。
同一次反應中針對不同的基因可單獨設置閾值,但對于同一個基因擴增一定要用同一個閾值。
Ct值:與起始濃度的對數(shù)成線性關(guān)系。
分析定量時候一般取Ct:15-35。太大或者太小都會導致定量的不準確。
Rn(Normalized reporter)是熒光報告基團的熒光發(fā)射強度與參比染料的熒光發(fā)射強度的比值。
△Rn:△Rn是Rn扣除基線后得到的標準化結(jié)果(△Rn=Rn-基線)。
2. 影響Ct值的關(guān)鍵因素
模板濃度
模板濃度是決定Ct的zui主要因素。控制在一個合適范圍內(nèi),使Ct在15-35之間。
反應液成分的影響
任何分子的熒光發(fā)射都受環(huán)境因素影響----比如溶液的pH值和鹽濃度。
PCR反應的效率
PCR反應的效率也會影響Ct值。在PCR擴增效率低的條件下進行連續(xù)梯度稀釋擴增,與PCR擴增效率高的條件下相比,可能會所產(chǎn)生斜率不同的標準曲線。PCR效率取決于實驗、反應混合液性能和樣品質(zhì)量。一般說來,反應效率在90-110%之間都是可以接受的。
3. 如何評估實時定量PCR反應的效果
PCR擴增效率:為了正確地評估PCR擴增效率,至少需要做3次平行重復,至少做5個數(shù)量級倍數(shù)(5logs)連續(xù)梯度稀釋模板濃度。
另一個評估PCR效率的關(guān)鍵參數(shù)是相關(guān)系數(shù)R2,它是說明兩個數(shù)值之間相關(guān)程度的統(tǒng)計學術(shù)語。如果R2等于1,那么你可以用Y值(Ct)來準確預測X值(量)。如果R2等于0,你就不能通過Y值來預測X值。R2值大于0.99 時,兩個數(shù)值之間相關(guān)的可信度很好。
標準偏差(standard deviation,偏差的平方根)是zui常用的度計量方法。如果許多數(shù)據(jù)點都靠近平均值,那么標準偏差就小;如果許多數(shù)據(jù)點都遠離平均值,則標準偏差就大。實際上,足夠多重復次數(shù)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)組會形成大致的正態(tài)分布。這經(jīng)常可通過經(jīng)典的中心極限理論來證明,獨立同分布隨機變量在無限多時趨向于正態(tài)分布。如果PCR反應效率是 100%,那么2倍稀釋點之間的平均Ct間隔應該恰為1個Ct值。要以99.7%的幾率分辨2倍稀釋濃度,標準偏差就必須小于等于0.167。標準偏差越大,分辨2倍稀釋的能力就越低。為了能夠在95%以上的情況下分辨出2倍稀釋,標準偏差必須小于等于 0.250。
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